肿瘤内可含有B细胞和浆细胞的浸润，但B细胞系的肿瘤浸润性细胞作用和抗原特异性尚不清楚。本文利用10x单细胞转录组测序技术探究了HPV阳性头颈部鳞状细胞癌患者肿瘤微环境中体液免疫反应的抗原特异性。

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文章题目：Defining HPV-specific B cell responses in patients with head and neck cancer.

中文题目：HPV特异性B细胞在头颈癌患者的应答

发表时间：2021.09

期刊名称：Nature

影响因子：49.962

实验平台：10x Genomics Chromium scRNA-seq

DOI：10.1038/s41586-020-2931-3

研究内容

TME中存在HPV特异性的ASCs

研究者首先从表达p16的头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）患者组织的FFPE切片中提取DNA并检测到人乳头瘤病毒（HPV）的DNA，p16是HPV状态的替代标志物。接下来，研究者在原发性肿瘤的肿瘤浸润性淋巴细胞（TILs）、转移性淋巴结（metLNs）和p16+HNSCC患者中外周血单核细胞（PBMCs）里计算抗体分泌细胞（ASCs）的数量。与PBMCs相比，TILs和metLNs中ASCs的富集程度更高。随后研究者尝试探究肿瘤微环境（TME）中的ASCs是否产生针对HPV抗原的特异性抗体。由于TME中IgG+ASCs经常出现，故利用经典的HPV癌基因E6和E7，和调节蛋白E2来研究抗原特异性IgG+ASCs特征。与宫颈癌不同，E2在大多数HPV相关的HNSCC中都有表达。在所测试的抗原中，E2的特异性反应占主导地位，18例患者配对的metLN和TIL样品里HPV特异性IgG+ASCs的频率具有相关性。然而在外周血中检测不到HPV特异性的ASCs，说明这是一种区域性的ASC反应。而在p16-HNSCC肿瘤中，淋巴细胞浸润程度明显降低，且缺乏HPV特异性的IgG+ASCs和IgG+记忆B细胞（MBCs）。综上所述，研究者发现TME中产生的HPV特异性IgG抗体处于活跃状态，而E2蛋白是体液免疫反应的主要靶点。

Fig.1 HPV阳性HNSCC患者TME中存在HPV特异性抗体分泌细胞

人HPV特异性抗体的生成

研究者在之前的研究中鉴定到一类抗原特异性B细胞并命名为“激活的B细胞”（ABCs）,是与ASCs不同的增殖细胞，属于MBC谱系并在接种疫苗或感染后出现在外周血液中。为了确认TME中是否存在HPV特异性ABCs并能产生HPV特异性人单克隆抗体，研究者利用流式分选技术和荧光标记的E2蛋白从HPV+ metLNs中纯化出HPV特异性ABCs，并制备单克隆抗体。此外，研究者还从单细胞分选的ASCs中获得另一种E2特异性单克隆抗体。E2特异性单克隆抗体在重链和轻链可变区表现出高度的体细胞超突变（SHM）。E2特异性单克隆抗体的重链可变区平均有28个SHM，明显高于急性病毒感染、潜伏性病毒感染等情况下产生的抗体，与HIV相当。研究者还从另一患者的ASCs中克隆到3种E6特异性抗体，也显示出高度的SHM。这些结果表明TME中存在针对肿瘤相关病毒抗原的ABCs和ASCs，而且ABC的存在和HPV特异性抗体中高水平的SHM暗示对这些病毒抗原长期不间断的体液免疫反应。

单细胞转录组测序分析TME中的B细胞

研究者使用单细胞转录组测序技术从3例HPV+HNSCC患者metLNs和TILs中获得的纯化细胞测序分析TME中B细胞系活化细胞的组成。此外，研究者还对一例接种季节性流感病毒疫苗的健康人外周血中分离出的活化细胞（接种7天后）进行单细胞转录组测序。上述所有单细胞测序共获得8271个细胞的结果，并鉴定到4种细胞类群，根据基因表达谱和基因集富集分析结果将这4群命名为ABC、ASC、生发中心B细胞（GCB）和暂时性细胞（表现为ASC、GCB和增殖基因集富集的杂交表型）。虽然这四种细胞类群中均含有来自metLNs和TILs的活化细胞，但是在GCB中没有接种疫苗的健康人细胞，在暂时性细胞里也几乎没有。这些结果表明，TME中包含几种抗原刺激过的B细胞类群：ABC、GCB和ASC。

为了研究三种主要B细胞类群的转录组差异，从患者和接种疫苗的健康人中分离出这三类细胞进行研究。首先利用主成分分析鉴定到两个主成分（PC），总共解释了大约６０％观察到的转录差异。PC1解释了41%的转录差异，能够区分ASC、ABC和GCB，并将组织和血液中的ABC区分开。在不考虑样品来源的情况下，ASC中常见的ASC相关基因表达上调而B细胞系基因表达下调。肿瘤来源的ASC除了上述特征，浆细胞相关基因也上调表达，表明肿瘤相关的ASC细胞表型更像浆细胞。GCB高表达的基因表明其促进对生发中心的限制作用。来源于外周血的流感特异性细胞与肿瘤来源的细胞不同，高表达参与细胞迁移的基因。TME中的B细胞和浆细胞可通过多种免疫调节蛋白抑制抗肿瘤免疫。值得注意的是，除了低水平表达到中等水平表达GZMB、IDO1和TGFBI的ASCs外，大多数前人描述的免疫调节基因表达水平都是不可检测或表达水平低，与初始B细胞的表达水平相当。

Fig.2 单细胞转录组测序鉴定TME中细胞类型组成

B细胞在肿瘤内的定位

最后，研究者用多重免疫组化方法研究B细胞和ASC在HPV+HNSCC肿瘤微环境的位置分布。与p16+肿瘤实质相比，B细胞和ASC整体倾向于分布在间质中。活化B细胞(CD19+CD20+Ki67+)在间质中密度较高，同时该区域存在ABC，表明生发中心反应存在于肿瘤间质中。TME中的ASC主要为Ki67-，但CD138表达水平具有很大差异，暗示浆细胞分化处于不同阶段。在HPV-HNSCC肿瘤中也观察到相似的趋势。总体而言，这些结果表明TME中存在几个不同的抗原特异性B细胞类群，包括ABC、GCB、近期生成的浆母细胞和处于不同分化阶段的浆细胞。

Fig.3 TME中B细胞和浆细胞的转录和空间特征

主要结论

本研究在HPV阳性的头颈癌患者样品中检测到HPV特异性的B细胞反应，并在原位产生HPV特异性IgG抗体。ASC细胞存在于TME中，而流感特异性细胞招募最少，表明存在局部的抗原特异性ASC反应。HPV特异性ASC反应与血浆IgG滴度相关，该反应针对HPV蛋白E2、E6和E7，其中对E2的反应最明显。研究者通过肿瘤内的B细胞和浆细胞生成了几种HPV特异性的人单克隆抗体，这些抗体表现出高水平的体细胞超突变，与慢性抗原暴露一致。单细胞转录组分析检测到TME中存在ABC、GCB和ASC。与肿瘤实质相比，B细胞和ASC优先定位于肿瘤间质，与ABC一起，表明生发中心反应正在进行。总体而言，研究者发现TME中存在抗原特异性活化细胞、GCB和浆细胞，为人类癌症体液免疫反应研究提供信息并提示肿瘤浸润性B细胞可以被用于开发治疗药物。

参考文献

Wieland, Andreas et al. “Defining HPV-specific B cell responses in patients with head and neck cancer.” Nature vol. 597,7875 (2021): 274-278.